YY/T 0878.2-2015.Test for complement activation of medical devices-Part 2 :Serum alternative pathway complement activation.
5.1 去纤维蛋白兔RBC和保存在奥尔塞氏(Alsever's)溶液中的绵羊RBC均在4 C条件下储存。绵羊RBC在保存8周后,或第2次洗涤上清中含有肉眼可见血色素(红色)时需丢弃(因为大多数RBC寿命的原因,它们会对补体裂解更敏感,同时自然裂解也增加)。兔RBC比绵羊RBC更易碎,应在保存4周后,或第2次洗涤上清中含有肉眼可见血色素(红色)时丢弃。
注:所有的离心应在4C条件下进行。除了另有说明,所有试剂,试管和细胞制剂都需置于碎冰或冰浴中保持冷状态。
5.2在4C条件下,将5mL绵羊或兔RBC在1000g下离心10min。
5.3将细胞沉淀悬浮于10mL冷BBS-GEDTA中,37C孵育10min.离心并使细胞沉淀重新悬浮于10 mL4 C的BBS-G-EDTA中。
5.4离心细胞， 丢弃上清(洗第1次),细胞沉淀重悬于10 mL冰冷的BBS-GM中(钙缓冲液)或BBSG-EDTA/Mg(镁缓冲液)中(用于吸收血清的细胞用钙缓冲液清洗;用于步骤B检测旁路途径补体消耗的细胞,用镁缓冲液清洗和悬浮)。重复2次(总共洗3次)。
5.5用分 光光度计法对细胞数量进行调节(当浓度为2.0X 10* RBC/mL,波长为412 nm.光程为1.0cm时,1体积清洗后的压积RBC加入24体积BBSGM或BBSGEGTA/Mg.绵羊RBC吸光度为0.75.兔RBC的吸光度为1.30)或用血球计数仪计数。制备10 mL4 C下BBS GM或、BBS G EGTA/Mg中浓度为2.0X10*细胞/mL的细胞悬液。
5.6经过清洗 、稀释的RBC冰上放置,至少可使用12 h.
6血清(补体)的吸收
6.1虽然在血液接触医疗器械材料旁路途径补体激活时,人血清优于豚鼠血清。但有遗传缺陷的人血清却不易获得。用抗体柱吸附法消耗补体成分的人血清不适用于该试验原因有以下两个:
a)特异性成分去除不完全.因此还会存在经典途径激活;和
b)柱材料可激活旁路途径,降低功能性活性。遗传缺陷C4豚鼠来源的血清[C4(-)GPS]没有经典途径补体活性但完全能胜任旁路途径补体激活。在检测生物材料补体激活作用时,虽然滴度不同(与人血清相比,裂解相同兔RBC所需C4(-)GPS)的浓度较大)[5],但C4(->)GPS可与人血清具有相近的生物补体激活效果(见表1中琼脂栅凝胶“举例)。因此,C4(-)GPS适合作为检测人类全血中旁路途径激活的补体成分以及裂解产物的确定性免疫测定的筛选试验。C4(-)GPS适用于从生物公司购买的补体源,通常标记为试剂级补体。
6.2可用绵羊RBC和兔RBC吸收血清以清除自发产生的抗绵羊RBC和抗兔RBC溶血性抗体。
6.2.1将购买的 C4(-)GPS储存于一70 C。
6.2.2将血清在碎冰上解冻或用冰水(如为冻干剂)复溶。
YY/T 0878.2-2015 医疗器械补体激活试验 第2部分:血清旁路途径补体激活