YY/T 0870.2-2013.Test for genotoxicity of medical devices-Part 2:In vitro mammalian chromosome aberration test.
10.2.2试验前一-天,将--定数量的细胞接种于培养皿(瓶)内,置于CO,培养箱内培养。
10.2.3吸去培养皿(瓶)中的培养液,加入试验或对照样品、S9混合液(不加S9混合液时,需用培养液补足)和细胞培养液,置于培养箱中。有或无代谢活化系统接触3 h~6 h,吸去培养皿(瓶)中的液体,用Hanks液洗细胞3次,加人新鲜细胞培养液继续培养，并在接触开始后约1.5倍的正常细胞周期时采样。若两者均为阴性结果,宜再延长无代谢活化的试验至1.5倍的正常细胞周期采样。
10.2.4于收获前2h~4 h加入细胞分裂中期阻断剂(如秋水仙素,终浓度为0.1 rg/mL~1 pg/ mL)。
10.3收获细胞与制片
10.3.1消化:用胰蛋白酶液消化细胞,待细胞脱落后加入含血消的细胞培养液终止胰蛋白酶作用,混匀,放入离心管内以1 0000 r/min~1 200 r/min离心5 min~7 min,弃去上清液。
10.3.2低渗:加入0. 075 mol/L氯化钾溶液5 mL~7 mL,用滴管将细胞轻轻地吹打混匀,放入37 C水浴中低渗处理10 min~20 min,加入1 mL~2 mL固定液(甲醇:冰醋酸,3: 1)混匀。以1 500 r/min离心5 min~7 min,弃去上清液。
10.3.3固定 :加入5 mL~7 mL固定液,混匀后固定10 min~20 min,以1500 r/min离心5 min~7 min,弃去上清液。同法再固定1~2次,弃去.上清液。
10.3.4滴片 :加人数滴新鲜固定液,混匀。将混悬液滴于冰水预冷的载玻片上,自然干燥。
10.3.5染色:将滴片用姬姆萨染液染色,晾干备用。
10.4结果观察
在光学显微镜下每--试验组至少选择200个分散良好的中期分裂相(染色体数为2n士2)进行染色体畸变观察。应记录每一观察细胞的染色体数目,对于畸变细胞还应记录畸变类型。
10.5推荐的观察项目
10.5.1染色体数 目的改变
10.5.1.1非整倍体 :亚二倍体或超二倍体。
10.5. 1.2多倍体: 染色体成倍增加。
10.5.1.3核内复制:包膜内的特殊形式的多倍化现象。
10.5.2染色体结构的改变
10.5.2.1断裂:损伤长度大于染色体的宽度。
10.5.2.2裂隙:损伤的长度小于染色单体的宽度。
10.5.2.3微小体:较断片 小而呈圆形.
YY/T 0870.2-2013 医疗器械遗传毒性试验 第2部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
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