SN/T 1559.1—2005.
1范围
SN/T 1559.1规定了直接免疫荧光试验检测非洲猪瘟病毒的方法。本标准适用于非洲猪瘟病毒的检测。
2仪器设备
2.1冷冻切片机。
2.2恒温培养箱。
2.3荧光显微镜。
2.4冰箱。
2.5 leigton管(160 mm×16 mm)。
3试验材料
3.1非洲猪瘟标准毒株。
3.2非洲猪瘟荧光抗体:使用前用稀释液稀释至工作浓度。
3.3蒸馏水(pH 7.4).配制方法参见附录A.
3.4 0.01 mol/L pH 7.4 PBS(磷酸盐缓冲液),配制方法参见附录A。
3.5︰缓冲甘油;使用中性无自发荧光的甘油(分析纯)配制,配制方法参见附录A。
3.6丙酮:使用前置冰箱预冷。
3.7待检组织:无菌采取可疑病猪的脾脏、扁桃体、肾脏、淋巴结,置于尽可能的低温、但不能冻结的容器内运送.保存。
4.1.2.5接种
每份组织悬液接种3管白细胞培养物,每管接种0.2 mL。置于5%CO。环境中，37℃培养2 d~4 d。
取Ⅰ管白细胞培养物接种非洲猪瘟标准毒株作阳性对照。另取1管白细胞培养物不接种病毒作阴性对照。
4.1.2.6 涂片
用已接种待检组织的白细胞培养物涂片,制成待检标本。用阳性对照管的细胞培养物涂片,制成阳性对照标本。用阴性对照管的细胞培养物涂片,制成阴性对照标本。
4.2固定
分别将上述标本在室温下自然风干,用预冷丙酮固定10 tmin。
4.3漂洗
将上述标本分别用0.01 mol/L pH 7.4 PBS漂洗3次,每次5 min,最后用蒸馏水漂洗3 min。
4.4加荧光抗体
在标本上滴加上作浓度的非洲猪瘟荧光抗体,然后将标本放入湿盒内,置于37℃恒温培养箱内温育1 h。
4.5漂洗
重复4.3,自然风干。
4.6镜检
于标本上滴加1滴缓冲甘油,置荧光显微镜下检查。
5结果判定
阴性对照的细胞无荧光产生,阳性对照的细胞出现荧光,则对照成立,可进行结果判定。待检标本的细胞出现荧光的,判定阳性。
待检标本的细胞无荧光出现的,判定阴性。
SN/T 1559.1—2005 非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程
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